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23/01/1995 Referência
 

PORTARIA SDA - 8, DE 23/01/1995

 
PORTARIA Nº 8, DE 23 DE JANEIRO DE 1995

- Método Analítico de Carcaça de Aves e Pesquisa de Salmonella

O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, usando da atribuição que lhe confere o Art. 78, item VII, do Regimento Interno da Secretaria, aprovado pela Portaria Ministerial nº 212, de 21 de agosto de 1992, resolve:

Art. 1º Aprovar as alterações introduzidas no método analítico de carcaças de aves e pesquisa de Salmonella, que com esta baixa, conforme normas anexas.

Art. 2º Revogar os itens 2.6 e 21, constantes da parte III, da Portaria nº 101, de 11 de agosto de 1993, publicada no Diário Oficial da União de 17 de agosto de 1993.

Art. 3º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação.

TÂNIA MARIA DE PAULA LYRA


ANEXO
MÉTODO ANALÍTICO DE CARCAÇA DE AVES E PESQUISA DE SALMONELLA

2.6 - CARCAÇA DE AVES
Quando congeladas, descongelar sob refrigeração por 18 horas. Pesar assepticamente, 25 gramas de pele e músculos das regiões do pescoço, cloaca e asas e homogeneizar com 225 ml de água peptonada a 0,1%. Preparar as diluições subsequentes com o mesmo diluente. Para pesquisa de Salmonella, pesar separadamente 25 gramos e adicionar 225 de Água peptonada 1% tamponada.

21 - PESQUISA DE Salmonella
Os membros do gênero Salmonella são agentes de infecções intestinais humanas e animais. Dentre os agentes de Doenças Veiculadas por Alimentos, o gênero Salmonella é um dos principais responsáveis por casos fatais e por complicações clínicas dos afetados. Desta forma, além da alta taxa de morbi-mortalidade, sua incidência no homem e animais implica em gastos significativos com medicamentos e hospitalizações.
As atividades de inspeção e fiscalização de alimentos têm, como objetivo crítico o controle e a prevenção dos membros deste grupo e das implicações de sua presença nos alimentos, assim como da observância de boas práticas de manufatura e dos programas de controle que devem incluir a certificação da adequacidade das medidas adotadas, em especial para este gênero de bactéria. Os métodos laboratoriais para a sua pesquisa incluem uma etapa de pré-enriquecimento, visando minimizar os efeitos do processo tecnológico de obtenção do alimento capaz de promover injúria fisiológica, sem inativá-las biologicamente.
A presença de salmonelas é determinada em 25 g ou ml da amostra sob análise, no mínimo. O resultado positivo para esta pesquisa é interpretado considerando o risco potencial que apresenta, o que significa impropriedade ao consumo do produto em questão.
21.1 - MEIOS DE CULTURA
Água peptonada a 1%, tamponada
Caldo tetrationato
Caldo Rappaport Vassiliadis
Caldo Selenito Cistina
Ágas RAMBACH
Ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) com novobiocina
Ágar xilose lisina desoxicolato (XLD)
Ágar para enterobacterias de Hektoen
Caldo uréia
Ágar tríplice açúcar ferro
Ágar lisina ferro
Ágar SIM
Caldo malonato-fenilalanina
Caldo dulcitol
Ágar Citrato de Simmons
21.2 - REAGENTES
Solução salina a 0,85%. estéril;
Solução iodo-iodeto (iodo 5g, iodeto de potássio 8,0 g, água destilada 40 ml);
Reativo de Kovacs (Paradimetilaminobenzaldeído 5,0g, álcool isoamílico 75,0 ml, ácido clorídrico concentrado 25,0ml). Dissolver o paradimetilaminobenzaldeído em álcool isoamílico e adicionar o ácido clorídrico, lentamente:
Solução aquosa de verde brilhante a 0,1%, estéril;
Solução aquosa de cloreto férrico a 10%;
Ácido clorídrico a 0,1 n
Solução aquosa de novobiocina a 4%, esterilizada por filtração.
21.3 - TÉCNICA
a) PRÉ-ENRIQUECIMENTO
Pesar assepticamente 25g da amostra, adicionar 225 ml de água peptonada a 1%, tamponada. Incubar a 35ºC, por 18-24 horas.
Exceções:
1 - Para o pré-enriquecimento de leite em pó e farinhas lácteas, dissolver 25g do produto em 225 ml de água peptonada a 0,1%, estéril, aquecida à 45ºC. Ajustar o pH para 6,8-6,9. Adicionar 5ml de solução aquosa de verde brilhante a 0,1%, estéril.
2 - No pré-enriquecimento de água de "chiller", homogeneizar e transferir 100 ml da amostra para um frasco contendo 50 ml de água peptonada a 1%, tamponada, em concentração tripla.
b) ENRIQUECIMENTO SELETIVO
Pipetar alíquotas de 0,1ml da cultura pré-enriquecida e transferir para tubos contendo 10 ml de caldo tetrationato ou de caldo selenito cistina. Incubar ambos os meios a 43ºC, por 24 horas, em banho-maria.
c) ISOLAMENTO E SELEÇÃO
A partir dos caldos de enriquecimento seletivo, semear em placas com ágar RAMBACH e de ágar BPLS adicionado de 0,1ml da solução de novobiocina a 4% por 100ml do meio ou ágar Hektoen. Incubar todas as placas a 35ºC por 24 horas.
Características das colônias de Salmonella:
1 - Em ágar RAMBACH as colônias de Salmonella apresentam-se de cor vermelha.
2 - Em ágar BPLS apresentam-se incolores ou de cor rosada, entre translúcida ou ligeiramente opacas. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose, poderão apresentar-se de cor verde-amarelada.
Em ágar Hektoen, apresenta-se de cor verde ou verde azuladas, revelando ou não a produção de ácido sulfídrico (H2S) (centro escuro).
Para leitura e interpretação verificar os quadros a seguir:






1 - Ágar TSI

Microrganismo
Base
Bisel
H2S
S. typhi
Amarela
Sem alteração ou vermelho
Positivo só na parte sup. da base
S. paratyphi A
Amarela com gás
Sem alteração ou vermelho
Negativo
S.cholerae suis



Spollorum
Amarela com gás
Sem alteração ou vermelho
Positivo (base preta)
S. paratyphi B
Amarela com gás
Sem alteração ou vermelho
Positivo (base preta)
S. typhimurium



S. enteritidis



S. gallinarum
Amarela
Sem alteração ou vermelho
Positivo (base preta)
S. dysenterias
Amarela
Sem alteração ou vermelho
Negativo
S. boydii



S. flexneri*



S. sonei
Amarela
Amarelo
Negativo
E. aerogenes
Amarela com gás
Amarelo
Negativo
E. cloacae



E. coli
Amarela com gás
Amarelo
Negativo
Klebsiella



C. freundii
Amarela com gás
Amarelo
Positivo
P. vulgaris
Amarela c/s gás
Sem alteração ou vermelho
Positivo(verde enegrecido)
P. mirabilis
Amarela c/s gás
Sem alteração ou vermelho
Positivo (verde enegrecido)
P. rettgeri
Amarela/vermelha
Sem alteração ou vermelho
Negativo
P. morganii
Amarela c/s gás
Sem alteração ou vermelho
Negativo
P. aeruginosa
S/alteração/verm.
Sem alteração ou vermelho
Negativo
*Sorotipo 6 - Variedade Newcastle com produção de gás na base





2 - Ágar Lisina Ferro

Microrganismo
Base
Bisel
H2S
Arizona
Violeta
Violeta
Positivo
Salmonella*
Violeta
Violeta
Positivo
P. mirabilis
Amarela
Pardo avermelhado
Positivo
P. vulgaris



P. rettgeri
Amarela
Pardo avermelhado
Negativo
Providência
Amarela
Pardo avermelhado
Negativo
C. freundii
Amarela
Violeta
Positivo
E. coli
Amarela
Violeta
Negativo
Shigella
Amarela/violeta
Violeta
Negativo
K. pneumoniae
Violeta
Violeta
Negativo
Exceção: S. paratyphi A, coluna amarela e bisel violeta (não produz lisina descarboxilase).
3 - Caldo malonato-fenilalanina:
a) Verificar se houve ou não a degradação do malonato pela viragem do indicador. A maioria das Salmonellas são malonato negativo.
b) Após leitura do malonato, adicionar algumas gotas de HCl 0,1 N até que o meio fique totalmente amarelo; acrescentar 3 a 4 gotas de cloreto férrico a 10%. A viragem para verde indica reação positiva, enquanto que a persistência da cor amarela indica reação negativa. As salmonelas são fenilalanina negativas.
4 - Caldo Dulcitol - 48 horas. Observar a fermentação do dulcitol pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo. A maioria das Salmonellas são dulcitol positivo.
5 - Ágar Citrato de Simmons - 96 horas. Semear com agulha a superfície inclinada do ágar. O crescimento com consequente mudança da cor do meio para azul indica a utilização do citrato como única fonte de carbono (reação positiva). A maioria das salmonelas são citrato positivo.
6 - Meio SIM - Interpretar conforme o quadro 3.

Realizar o teste sorológico dos cultivos que apresentarem os seguintes resultados:
- Urease-negativa
- Produção de H2S - positiva
- Descarboxilação da lisina - positiva
- Utilização do citrato - positiva ****
- Produção de indol - negativa
- Motilidade - positiva *
- Assimilação do malonato - negativo **
- Fermentação de Dulcitol - positiva ***
- Fenilalanina - negativa
* - S. Pullorum e S. Gallinarum são imóveis
** - S. arizonae assimila o malonato
*** - S. arizonae não fermenta o dulcitol
**** - 25% das cepas de Salmonella são citrato negativo.
d) TESTE SOROLÓGICO-AGLUTINAÇÃO RÁPIDA
Adicionar ao cultivo em ágar nutritivo inclinado aproximadamente a 2ml de solução salina e 0,85%. Homogeneizar.
Com pipeta de Pasteur depositar separadamente em lâmina de vidro, duas gotas da suspensão. Acrescentar 1 gota do soro anti-Salmonella polivalente "O" sobre uma das gotas da suspensão na lâmina e misturar, e sobre a outra, 1 gota de solução salina.
Realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 1-2 minutos.
Classificar a reação do seguinte modo:
1 - Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo antisoro.
2 - Negativa: ausência de aglutinação em ambas as misturas.
3 - Não específica: presença de aglutinação em ambas as misturas (formas rugosas).
OBS: Os cultivos com resultados positivos no teste de aglutinação com o soro anti-Salmonella polivatene "O" deverão ser remetidas ao Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro para sua tipificação final.
21.4 - COMPOSIÇÃO E PREPARO DOS MEIO DE CULTURA
a) ÁGUA PEPTONADA A 1% TAMPONADA
Peptonada de carne...............................................................................................10,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)........................................................................................... 5,0g
Fosfato de sódio (NaHPO4).................................................................................. 9,0 g
Fosfato de potássio (KH2PO4)............................................................................... 5,0 g
Dissolver os componentes em 1 litro de água destilada/deionizada.
Distribuir em frascos volumes de 225 ml e autoclavar a 121ºC, por 15 minutos.
pH final 7,2 0,2
b) CALDO SELENITO CISTINA
Triptona................................................................................................................. 5,0 g
L (-) cistina (C6H12N2O4S2)................................................................................... 0,01 g
Lactose (C12H22O11H2O).......................................................................................... 4,0 g
Fosfato dissódico (Na2HPO42H2O)........................................................................ 2,0 g
Bi-Selenito de sódio.............................................................................................. 4,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 7,0 0,2
c) CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS
Peptona de soja.......................................................................................................5,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................8,0 g
Fosfato monopotássico (KH2PO4)...........................................................................1,6 g
Cloreto de magnésio 6H2O...................................................................................40,0 g
Verde malaquita....................................................................................................0,04 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 5,2 0,2
d) ÁGAR VERDE BRILHANTE VERMELHO DE FENOL LACTOSE SACAROSE (BPLS)
Peptona de carne.....................................................................................................5,0 g
Peptona de caseína..................................................................................................5,0 g
Extrato de levedura.................................................................................................3,0 g
Lactose (C12H22O11H2O).........................................................................................10,0 g
Sacarose (C12H22O11)..............................................................................................10,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)................................................. ........................................5,0 g
Fosfato dissódico (Na2HPO4)..................................................................................2,0 g
Verde Brilhante (C21H14Br4O5S)........................................................................0,0125 g
Vermelho de fenol (C19H14O5S).............................................................................0,08 g
Ágar......................................................................................................................12,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual. Antes do plaqueamento, adicionar 1 ml de sol. de novobiocina a 4% por litro de meio de cultura.
pH final 6,9 0,1
e) ÁGAR PARA ENTEROBACTERIAS DE HEKTOEN
Protease-peptona....................................................................................................12,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................5,0 g
Extrato de levedura.................................................................................................3,0 g
Lactose (C12H22O11H2O).........................................................................................12,0 g
Sacarose (C12H22O11)..............................................................................................12,0 g
Salicina (C13H18O7)..................................................................................................2,0 g
Tiosulfato de sódio (Na2S2O3).................................................................................5,0 g
Citrato de ferro e amônia........................................................................................1,5 g
Sais biliares.............................................................................................................9,0 g
Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S)...................................................................0,064 g
Fucsina ácida........................................................................................................0,04 g
Ágar......................................................................................................................13,5 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 7,5 0,1

f) ÁGAR RAMBACH
Peptona...................................................................................................................8,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................5,0 g
Micela Cromogema................................................................................................1,5 g
Propilenoglicol.....................................................................................................10,5 g
Desoxicolato de sódio (C24H39NaO4).......................................................................1,0 g
Ágar......................................................................................................................15,0 g
ADITIVO: 1 vial de agentes seletivos, que acompanha o meio, para cada 250 ml de ágar RAMBACH.
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas na embalagem ou manual. NÃO AUTOCLAVAR.
pH final 7,4 0,2
g) CALDO URÉIA
Extrato de levedura.................................................................................................0,1 g
Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4).............................................................9,1 g
Hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4)..................................................................9,5 g
Uréia (H2NCONH2)................................................................................................20 g
Vermelho de fenol (C19H14O5S)...............................................................................0,1 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 6,8 0,1
h) ÁGAR LISINA FERRO (LIA)
Peptona...................................................................................................................5,0 g
Extrato de levedura.................................................................................................3,0 g
Glicose (C6H12O6)....................................................................................................1,0 g
L-Lisina (C6H15ClN2O2).........................................................................................10,0 g
Citrato férrico amoniacal........................................................................................0,5 g
Tiosulfato de sódio (Na2S2O3)...............................................................................0,04 g
Púrpura de bromocresol (C21H16Br2O5S)...............................................................0,02 g
Ágar......................................................................................................................15,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual. Após autoclavação, deixar os tubos solidificarem em posição inclinada de maneira a formar um bisel de aproximadamente 2 cm.
pH final 6,7 0,1
i) ÁGAR TRIPLICE AÇUCAR FERRO (TSI)
Extrato de Carne.....................................................................................................3,0 g
Extrato de levedura.................................................................................................3,0 g
Peptona de caseína................................................................................................15,0 g
Peptona de carne.....................................................................................................5,0 g
Lactose (C12H22O11H2O).........................................................................................10,0 g
Sacarose (C12H22O11)..............................................................................................10,0 g
D( ) Glicose (C6H12O6H2O)....................................................................................1,0 g
Citrato de amônio e ferro........................................................................................0,5 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................5,0 g
Tiosulfato de sódio (Na2S2O3).................................................................................0,3 g
Vermelho de fenol (C19H14O5S)...........................................................................0,024 g
Ágar......................................................................................................................12,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual. Após autoclavação, deixar os tubos solidificarem em posição inclinada de maneira a formar um bisel de cerca de 2 cm.
pH final 7,4 0,1
j) MEIO SIM
Peptona de caseína................................................................................................20,0 g
Peptona de carne.....................................................................................................6,6 g
Citrato de amônio e ferro III...................................................................................0,2 g
Tiosulfato de sódio (Na2S2O3).................................................................................0,2 g
Ágar........................................................................................................................3,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 7,3 0,1
l) ÁGAR CITRATO DE SIMMONS
Dihidrogenofosfato de amômio (NH2PO4).............................................................1,0 g
Fosfato de Potássico (K2HPO4)...............................................................................1,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................5,0 g
Citrato de sódio (C6H5O7Na3 2H2O)........................................................................2,0 g
Sulfato de magnésio (MgSO4 7H2O).........................................................................0,2 g
Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S).....................................................................0,08 g
Ágar......................................................................................................................12,0 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual.
pH final 6,9 0,1
m) CALDO MALONATO-FENILALANINA
Extrato de levedura.................................................................................................1,0 g
Sulfato de amônio ((NH4) 2SO4)..............................................................................2,0 g
Fosfato de Potássico (K2HPO4)...............................................................................0,6 g
Fosfato monopotássico (KH2PO4).............................................................................0,4 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................2,0 g
Malonato de sódio (C3H2Na2O4)..............................................................................3,0 g
Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S)...................................................................0,025 g
Fenilalanina (C9H11NO2)..........................................................................................1,0 g
Dissolver os componentes em 1 litro de água destilada/ deionizada.
Distribuir em tubos volumes de 5ml, e autoclaver a 115ºC, por 10 minutos.
pH final 6,6 0,1
n) CALDO VERMELHO DE FENOL BASE
Triptona..................................................................................................................5,0 g
Peptona de carne.....................................................................................................5,0 g
Cloreto de sódio (NaCl)..........................................................................................5,0 g
Vermelho de fenol (C19H14O5S)...........................................................................0,018 g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendações contidas no rótulo ou manual. Após autoclavação adicionar 0,5% de Dulcitol esterilizado por filtração e distribuir em tubos estéreis.
pH final 7,4 0,2
 
Este texto não substitui o publicado no D.O. (origem) de (data de publicação)
 
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